9.2.2 QIMICOS

9.2.2 Químicos:

Son basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, bien sea directamente mediante la ruta endocítica (fosfato cálcico, DEAE dextrano) o a las membranas (lipofección).

Actualmente uno de los campos de estudio más importantes por lo que se refiere a les técnicas de transferencia de genes, son los estudios realizados con los llamados vectores sintéticos (también usados en técnicas de terapia génica), con tal de evitar los problemas derivados de la utilización de virus para la transferencia de genes.

Los vectores sintéticos (han tenido una alta eficacia in vitro, pero una baja in vivo) son de producción sencilla, altamente estables, y se pueden conseguir grandes construcciones.

Método del fosfato cálcico.

Basado en la obtención de un precipitado entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos. En esta situación co-precipitan formando unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares. El tamaño y la calidad del precipitado es crítico para el éxito del proceso, que se ve afectado por factores tales como pequeños cambios en el pH de la solución, etc.  

Método del DEAE dextrano.

Basado en la obtención de complejos entre la resina DEAE y el DNA. Los polímeros de DEAE dextrano o polybreno tienen una carga que les permite unirse a las muy negativamente cargadas moléculas de DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerol. El uso de DEAE dextrano se limita a las transfecciones transientes. 

Método DNA desnudo.

El DNA desnudo (técnica en fase altamente experimental) es incapaz de entrar en una célula y aún consiguiendo entrar en ellas es rápidamente degradado. La línea de investigación busca incorporar esas secuencias de DNA a un transportador, que le encierra y le lleva hasta la célula Diana en dónde a través de interacciones de membrana se asocia con ella para entregar el material al interior.

Método Péptidos fusiogénicos.

 Los  péptidos fusiogénicos surgen en una linea de trabajo que nos permita paliar aquellas características del DNA desnudo que nos impiden la entrada.

 Estos péptidos fusiogénicosa se utilizan para compactar DNA. y de este modo adoptan DNA con proteínas ricas en cargas +, del tipos Histonas. Esto supone una condensación considerable, (visible con MET) ya que el DNA aparece en la forma de partículas de 50-150 nanometros, pero sólo un cierto grado de condensación permite que 1 transportador incluya 1 molécula de DNA. Asimismo la reducción de tamaño del DNA hasta unos 20 nanometros facilitaría el paso a la célula y hasta el núcleo, incrementando su protección contra las nucleases citoplasmáticas. En el proceso de penetración celular, los transportadores sintéticos (si su carga neta es +) interactuan con Aminoazucares de la Membrana plasmáticacon (carga -) para producir la incorporación a la célula en forma de endosomas. Por tanto tenemos un problema más a superar.

También se ha visto que los puntos en dónde se da una mayor transferencia son los pulmones y el hígado, con lo que se considera que los transportadores se agrupan en grandes complejos y que interactuan con proteínas de la sangre, con lo que no abandonan eficazmente el sistema vascular, finalmente son retenidos por los filtros naturales del cuerpo, tales como los pulmones o el hígado, en dónde interactuan.

Esto marca dos puntos a superar en este modelo de transferencia de genes in vivo, en primer lugar el superar los filtros naturales que presenta todo organismo, en segundo punto dirigir el transportador dentro del cuerpo con tal de incrementar la afinidad a las células diana.

Método  de Liposomas.

Los liposomas estan formados por DNA y lipidos no inmunogénicos cargados positivamente (lípidos cationicos).

Inicialmente se empezó a trabajar con lípidos no inmunogénicosados, ya que la organización de los lípidos en bicapa podría facilitar el paso a través de la membrana citoplasmática. Aunque estos lípidos no englobaban mucho DNA.
A raiz de esto se crearon los liposomas que superan el problema de la compactación debido a que el DNA se contornea como consecuencia de las cargas positivas de lípidos (en los liposomas DNA está ocho veces más condensados que en  lípidos normales). Además se pretende controlar su destino mediante proteinas en membrana de liposoma. Una característica en común con la anterior es que se forman de forma espontanea si se colocan los dos en un mismo medio.

Finalmente decir que estos complejos liposomales son del orden de 104 veces de eficiencia menor que los complejos víricos, presentan un alto grado de interferencia/inhibición en el proceso de transcripción del gen, así como en el hecho del mantenimiento del gen (por los sistemas de recombinación homóloga, fijación en el genoma) y los problemas derivados de su regulación.

Se pueden sintetizar vectores de hasta 400 kb, se les puede incluir además los sistemas de regulación de la transcripción del gen.