10.2 TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
Existen dos tipos de hibridaciones de ácidos nucleicos que se usan frecuentemente en los laboratorios que utilizan técnicas de biología molecular.
Ambos métodos utilizan una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea con radiactividad o bien con un fluorocromo. Esta cadena tiene una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de secuencia parecida.
Southern
El método tipo Southern o Southern blot fue desarrollado para la detección de genes específicos en el ADN celular.
El ADN es digerido con una enzima de restricción y los fragmentos son separados por tamaños mediante una electroforesis en un gel. A continuación los fragmentos de ADN de doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso químico separando las dos hebras componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuación el filtro se incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo); durante la incubación la sonda se va hibridando a las moléculas de ADN de cadena sencilla de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una exposición a una película de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una película
Northern
El segundo método, tipo [[Northern blot] o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el método northern sirve para identificar ARN.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaños variables mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso continúa de forma semejante a la hibridación de tipo Southern. El método del northern se utiliza muy frecuentemente para realizar estudios de expresión génica; para conocer qué genes están activos formando ARN mensajero en qué condiciones, en qué tejidos o tipos celulares.
Hibridación in situ
Un desarrollo de las técnicas de preparación y fijación de materiales biológicos para su observación al microscopio, junto con el desarrollo de técnicas de hibridación tipo northern ha llevado a poder realizar la hibridación de las sondas directamente sobre tejidos de material orgánico. Utilizando técnicas inmunohistoquímicas se puede conocer la localización precisa de los tejidos y células que están expresando los genes de secuencia complementaria a las sondas utilizadas. También en esta categoría destaca el FISH, técnica de hibridación in situ, donde las sondas son secuencias de ADN marcadas que se unen a secuencias de ADN conocidas dentro del cromosoma, con la que comparte un alto grado de similitud y que podemos observar con un microscopio óptico de fluorescencia.
Chip de ADN
El siguiente paso en el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la miniaturización de los filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices microscópicas en forma de chip de ADN. De esta manera se pueden colocar en una matriz una inmensa cantidad de copias génicas diferentes y mediante un proceso de hibridación detectar todas aquellas que tienen una secuencia parecida. Modificando las características de las moléculas presentes en la matriz así como cambiando las sondas utilizadas, las posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los Chip de ADN son enormes.
PCR
La PCR, o Reacción en Cadena de la Polimerasa, utiliza un paso de hibridación de oligonucleótidos para completar el proceso. Entre el paso de desnaturalización de las hebras del ADN y antes del paso de extensión del cebador hay un paso de unión de los cebadores a la hebra de secuencia complementaria mediante una hibridación de ADN. Es el paso de menor temperatura de la PCR y el que marca la especificidad de la reacción.
BIBLIOGRAFÍA:
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