4.4 REPLICASION IN VITRO (PCR)

4.4 REPLICASION IN VITRO DEL ADN (PCR)

Replicación del ADN in vitro: Reacción en cadena de polimerasa y la Agarose Gel Electrophoresis electroforesis en gel de agarosa  

I. Principle I. Principio   

Polymerase Chain Reaction Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (PCR) is a key technique used in molecular genetics to reproduce a relatively short sequence of DNA; this segment of DNA is often a gene or a critical part of the gene and PCR amplifies Es una técnica clave utilizada en la genética molecular para reproducir una secuencia relativamente corta de ADN; este segmento de ADN a menudo es un gen o una parte crítica del gen y amplifica por PCR (ie, makes more copies of) (Es decir, hace más copias de) the sequence of interest allowing us to study just that particular sequence. la secuencia de interés que nos permite estudiar lo que la secuencia particular. Before PCR was invented, DNA amplification was done in bacteria and took weeks to accomplish. Antes de PCR fue inventada, la amplificación de ADN se llevó a cabo en bacterias y tomó semanas para llevar a cabo. PCR uses the same molecules that nature uses for copying DNA. PCR utiliza las mismas moléculas que la naturaleza utiliza para copiar el ADN.

In order to determine whether or not you amplified the correct gene or to check if that gene is present, we use agarose electrophoresis. Con el fin de determinar si está o no amplificado el gen correcto o para comprobar si ese gen está presente, se utiliza electroforesis de agarosa. Agarose creates a matrix that allows smaller DNA molecules to travel faster and larger DNA molecules to travel slower thus separating the DNA molecules according to size when applied through a electrical field. Agarosa crea una matriz que permite que las pequeñas moléculas de ADN para viajar más rápido y más grandes moléculas de ADN para viajar más lento separando así las moléculas de ADN de acuerdo con el tamaño cuando se aplica a través de un campo eléctrico.

II. II. Explanation Explicación

A. The cycling reactions: A. Las reacciones de ciclismo:

There are three major steps in a PCR, which are repeated for 30 or 40 cycles. Hay tres pasos principales en una PCR, que se repiten durante 30 o 40 ciclos. This is done on an automated thermal cycler, which can heat and cool the tubes with the reaction mixture in a very short time. Esto se hace en un ciclador térmico automatizado, que puede calentar y enfriar los tubos con la mezcla de reacción en un tiempo muy corto.

1. Denaturation Desnaturalización (94-95°C) (94-95 ° C) : :
   During the denaturation, the double strand melts, or denatures Durante la desnaturalización, la doble cadena se funde, o desnaturaliza (which means opens) (Lo que significa abre) , to single stranded DNA and all enzymatic reactions stop , Con el ADN de cadena sencilla y todas las reacciones enzimáticas detener (for example: the extension from a previous cycle) (Por ejemplo: la extensión de un ciclo anterior) . .
2. Annealing Recocido (54-60°C) (54-60 ° C) : :
   The primers are jiggling around which is caused by Brownian motion. Los cebadores se jiggling alrededor de la cual es causada por el movimiento browniano. Hydrogen bonds are constantly formed and broken between the single stranded primer and the single stranded template. Los enlaces de hidrógeno están constantemente formado y roto entre el cebador de cadena sencilla y la plantilla monocatenario. The more stable bonds last a little bit longer Los bonos más estables duran un poco más (primers that fit exactly) (Cebadores que se ajustan exactamente) and on that little piece of double stranded DNA y en ese pequeño pedazo de ADN de doble cadena (template and primer) (Plantilla y cartilla) , the polymerase can attach and start to copy the template. , La polimerasa puede conectar y empezar a copiar la plantilla. Once there are a few bases built in, the hydrogen bonds are so strong between the template and the primer that it does not break anymore. Una vez que hay unas pocas bases construidas en los enlaces de hidrógeno son tan fuertes entre la plantilla y la cartilla de que no se rompe más. The actual annealing temperature is determined by the primer sequence using their melting temperatures, referred to as Tm. La temperatura real de recocido está determinada por la secuencia del cebador utilizando sus temperaturas de fusión, referidos como Tm.
3. Extension Extensión (68 - 74°C) (68 - 74 ° C) : :
   Extension is when the free nucleotides that complement the single strand of DNA are added onto the 3' end of the primer. La extensión es cuando los nucleótidos libres que complementan la sola hebra de ADN se añadió en el extremo 3 'del cebador. This is the ideal working temperature for the polymerase. Esta es la temperatura de trabajo ideal para la polimerasa. The primers have a stronger attraction to the template, created by hydrogen bonds. Los cebadores tienen una atracción fuerte al plantilla, creado por enlaces de hidrógeno. It is more difficult to break these bonds than it is to add free nucleotides to the primers. Es más difícil de romper estos lazos de lo que es para añadir nucleótidos libres a los cebadores. Primers can bind to the single stranded DNA even if there are not exactly complementary. Los cebadores pueden unirse al ADN monocatenario incluso si no son exactamente complementaria. But if the “match” is with too few nucleotides, then there are fewer hydrogen bonds. Pero si el "partido" está con muy pocos nucleótidos, entonces hay un menor número de enlaces de hidrógeno. Thus, the primer can fall off the single stranded nucleotide because of the higher temperature and there will be no extension of the fragment Así, el cebador puede caerse el nucleótido monocatenario debido a la temperatura más alta y no habrá extensión del fragmento (the single strand of DNA you are trying to copy.) (La única hebra de ADN que está intentando copiar.)
   The bases Las bases (complementary to the template) (Complementaria a la plantilla) are coupled to the primer on the 3' side están acoplados a la imprimación sobre el lado 3 ' (the polymerase adds dNTP's from 5' to 3', reading the template from 3' to 5' side, bases are added complementary to the template) (La polimerasa añade dNTP desde 5 'a 3', la lectura de la plantilla de 3 'a 5' lado, las bases complementarias se añaden a la plantilla)

Because both strands are copied during PCR, there is an exponential increase of the number of copies of the gene. Debido a que ambas cadenas se copian durante la PCR, hay un aumento exponencial del número de copias del gen. Suppose there is only one copy of the wanted gene before the cycling starts, after one cycle, there will be 2 copies, after two cycles, there will be 4 copies, three cycles will result in 8 copies and so on. Supongamos que hay sólo una copia del gen deseado antes de que el ciclo se inicia, después de un ciclo, habrá 2 copias, después de dos ciclos, habrá 4 copias, tres ciclos se traducirá en 8 copias y así sucesivamente.

The first 4 cycles of a PCR reaction in detail in shown above. Los primeros 4 ciclos de una reacción de PCR en detalle en muestra arriba. In the 3rd cycle, two double strands of the right length are copied En el ciclo tercero, dos cadenas dobles de la longitud correcta se copian (the forward and reverse strand are the same in length) (La hebra de avance y retroceso son los mismos de longitud) . . In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are copied. En el ciclo de 4 º, 8 cadenas dobles de la longitud correcta se copian.

    

B. Is there a gene copied during PCR and is it the right size? B. ¿Existe un gen de copia durante la PCR y es el tamaño adecuado?

Before the PCR product is used in further applications, it has to be checked if: Antes de que el producto de PCR se utiliza en otras aplicaciones, que se ha de comprobar si:

1. There is a product formed. Hay un producto formado.
   Though biochemistry is an exact science, not every PCR is successful. A pesar de la bioquímica es una ciencia exacta, no todos los PCR es un éxito. There is for example a possibility that the quality of the DNA is poor, that one of the primers doesn't fit, or that there is too much starting template. Existe por ejemplo la posibilidad de que la calidad del ADN es pobre, que uno de los cebadores no se ajusta, o que hay plantilla de partida demasiado.
2. The product is of the right size. El producto es del tamaño adecuado.
   It is possible that there is a product, for example a band of 500 bases, but the expected gene should be 1800 bases long. Es posible que exista un producto, por ejemplo una banda de 500 bases, pero el gen debe ser esperado 1800 bases de longitud. In that case, one of the primers probably fits on a part of the gene closer to the other primer. En ese caso, uno de los cebadores probablemente encaja en una parte del gen más cerca de otro cebador. It is also possible that both primers fit on a totally different gene. También es posible que ambos cebadores caber en un gen totalmente diferente.
3. Only one band is formed. Sólo una banda se forma.
   As in the description above, it is possible that the primers fit on the desired locations, and also on other locations. Como en la descripción anterior, es posible que los cebadores caber en los lugares deseados, y también en otros lugares. In that case, you can have different bands in one lane on a gel. En ese caso, usted puede tener diferentes bandas en un solo carril en un gel.

Figure: Verification of the PCR product on gel. Figura: Verificación del producto de PCR en gel.

The ladder is a mixture of fragments of known size. La escalera es una mezcla de fragmentos de tamaño conocido. Running a ladder with your PCR product allows comparison of the PCR fragments, thereby enabling identification of band size. Ejecución de una escalera con su producto de PCR permite la comparación de los fragmentos de PCR, lo que permite la identificación del tamaño de la banda. Notice that the distance between the different fragments of the ladder is logarithmic. Tenga en cuenta que la distancia entre los diferentes fragmentos de la escala es logarítmica. Lane 1: PCR fragment is approximately 1850 bases long. Carril 1: fragmento de PCR es de aproximadamente 1850 bases de longitud. Lane 2 and 4: the fragments are approximately 800 bases long. Carril 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800 bases de largo. Lane 3: no product is formed, so the PCR failed. Carril 3: ningún producto se forma, por lo que la PCR ha fallado. Lane 5: multiple bands are formed because one of the primers fits on different places Carril 5: múltiples bandas se forman porque uno de los cebadores se adapta a diferentes lugares (or perhaps there is more than one template from different species) (O quizás hay más de una plantilla de diferentes especies) . .

C. What are we looking for? The gene you will be amplifying today is called Dct- Endothelin receptor B (Ednrb) which is actually a transgene that can be inserted into another organism. C. ¿Qué estamos buscando? El gen que será de amplificación que hoy se llama dct-receptores de la endotelina B (EDNRB), que es en realidad un transgén que puede ser insertado en otro organismo. Dct, or dopachrome tautomerase, is expressed in melanocytes (pigment cells) and so by using this transgene we can target the insertion of the gene, Ednrb , thereby controlling where it is expressed. Dct, o tautomerasa dopacromo, se expresa en los melanocitos (células de pigmento) y así mediante este transgén podemos dirigir la inserción del gen, EDNRB, controlando de este modo en el que se expresa. This is very important when you want to study whether certain genes interact with each other (whether it by directly or indirectly) or not. Esto es muy importante cuando se quiere estudiar si ciertos genes interactúan entre sí (si directamente o indirectamente) o no.

To check if the Dct- Ednrb transgene was successfully passed from parent to progeny, you must check to see if Dct is present. Para comprobar si los transgenes dct-EDNRB fue aprobada con éxito de los padres a la progenie, usted debe comprobar para ver si la DCT se presente. This is because every animal alive has endogenous Ednrb and so checking for Ednrb will always be positive. Esto se debe a todos los animales vivos tiene EDNRB endógeno y lo que la comprobación de EDNRB siempre será positivo. To amplify Dct, you will use primers that anneal on each side of the Dct gene and this will direct the Taq where to begin and where to end amplification. Para amplificar Dct, que va a utilizar cebadores que se reasocian a cada lado del gen DCT y este dirigirá la Taq dónde empezar y dónde terminar amplificación. This is not a totally clean PCR, meaning that you will see some non-specific binding that will create bands that are not of interest. Esto no es una totalmente limpia de PCR, lo que significa que podrás ver algunos de unión no específica que va a crear bandas que no son de su interés. In a way it is good to have this non-specific band (which is always there regardless of whether the animal is Dct positive or not) because it indicates that the PCR worked. En cierto modo, es bueno tener esta banda no específica (que siempre está ahí, independientemente de si el animal es positivo o no Dct), ya que indica que la PCR trabajó. The band of interest (ie, indicating the animal does contain the transgene Dct- Ednrb ) is 2217bp long. This is a sensitive PCR so work cautiously. La banda de interés (es decir, lo que indica que el animal contiene el transgén dct-EDNRB) es 2217bp largo. Este es un tema delicado PCR para trabajar con mucho cuidado.

III. III. General Safety Requirements Requisitos generales de seguridad

1. 1. Always wear lab coat and gloves. Siempre use una bata de laboratorio y guantes.

2. 2. Do not talk while tubes are open as your DNA can mix in with the DNA being used and even more important, you can contaminate the reagents used in the reaction No hables mientras que los tubos están abiertos como el ADN se puede mezclar con el ADN que se utiliza y aún más importante, que puede contaminar los reactivos empleados en la reacción (and then nothing will work) (Y entonces nada va a funcionar) . .

3. 3. Hold pipetter in a vertical position, with the tip facing down. Mantener pipeteador en una posición vertical, con la punta hacia abajo.

4. 4. If using Ethidium bromide proceed with caution as it is a mutagen. Si se utiliza bromuro de etidio proceder con cautela, ya que es un mutágeno.

Bibliografía:

ww.cultek.com/.../PCR/Aplicaciones-in vitro PCR-