unIdad 4 portada, introduccion, objetivos y metodologia

SEP                    SNEST                 DGEST

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CD.

ALTAMIRANO GRO

LIC: BIOLOGIA

MATERIA: BIOLOGIA MOLECULAR

ALUMNA:

DULCE DIANA ALVARADO JAIMES

NUMERO DE CONTROL:

09930345

LIC: BIOLOGIA  Vl. SEMESTRE.

 

CD. ALTAMIRANO, GRO. MEXICO. MARZO DEL 2012

UNIDAD 4.-

4.-	Replicación del ADN	4.1 replicación del genoma procariotico
		4.2 replicación del genoma eucariontico
		4.3 control genético de la replicación
		4.4replicasion in vitro del ADN (PCR)
		4.5 secuenciación del ADN

INTRODUCCION:

Replicación del ADN

Es el mecanismo que permite al ADN duplicarse (es decir, sintetizar una copia idéntica). De esta manera de una molécula de ADN única, se obtienen dos o más "clones" de la primera. Esta duplicación del material genético se produce de acuerdo con un mecanismo semiconservativo, lo que indica que las dos cadenas complementarias del ADN original, al separarse, sirven de molde cada una para la síntesis de una nueva cadena complementaria de la cadena molde, de forma que cada nueva doble helice contiene una de las cadenas del ADN original. Gracias a la complementariedad entre las bases que forman la secuencia de cada una de las cadenas, el ADN  tiene la importante propiedad de reproducirse idénticamente, lo que permite que la información genética se transmita de una celula madre a las celulas hijas y es la base de la herencia del material genético.

La molecula de ADN se abre como una cremallera por ruptura de los PUENTES DE HIDROGENO entre las bases complementarias liberándose dos hebras y la ADN plolimerasa  sintetiza la mitad complementaria añadiendo nucleotidos que se encuentran dispersos en el nucleo. De esta forma, cada nueva molecula es idéntica a la molecula  de ADN  inicial.

La replicación empieza en puntos determinados: los origenes de replicasion . Las proteinas iniciadoras reconocen secuencias de nucleotidos específicas en esos puntos y facilitan la fijación de otras proteinas que permitirán la separación de las dos hebras de ADN formándose una horquilla de replicasion. Un gran número de enzimas y proteinas intervienen en el mecanismo molecular de la replicación, formando el llamado complejo de replicación o replisoma. Estas proteinas  y enzaimas son homólogas en eucariotas  y arqueas, pero difieren en bacterias.

OBJETIVOS:

v  Comprender como se lleva a cabo el proceso de replicación del ADN tanto en procariontes como en eucariontes que rigen el control de los procesos celulares como la expresión génica, así como su control genético de estos mecanismos y técnicas para conocer su replicación in vitro (PCR) y la secuenciación que esta tiene que llevar a cabo para su desarrollo.

v      Entender las aplicaciones mediante técnicas para llevar a cabo su replicación y secuenciación de la expresión génica y de la manipulación del ADN   mediante el empleo de las diferentes técnicas moleculares que le permitan desarrollar proyectos de investigación básica y aplicada.

METODOLOGIA:

Los pasos a seguir para llevar a cavo el desarrollo y publicación de cada unos de los puntos de los subtemas de esta unidad, lo llevare a cavo mediante la elaboración y publicación de cada uno de los subtemas desarrollados publicándolos  con la bibliografía al final de cada subtema y con una conclusión de la unidad en general con claridad y con la información más importante de cada uno de ellos, y con la fecha que el profesor indique.

  

EXPERIMENTO DE MESELSON

LA REPLICACIÓN DEL ADN BACTERIANO SE AJUSTA AL MODELO SEMICONSERVATIVO: EXPERIMENTOS DE MESELSON Y STAHL (1958)

Meselson y Stahl (1957) diseñaron un experimento para tratar de averiguar la forma en la que se realiza la replicación del ADN en E. coli, es decir, la pregunta que se plantearon fue: ¿Qué modelo de replicación del ADN sigue E. coli, semiconservativo, conservativo o dispersivo?. Para contestar a esta pregunta, diseñaron un experimento en el que marcaban el ADN de la bacteria E. coli con Nitrógeno pesado N¹⁵, para ello hicieron crecer las bacterias durante 14 generaciones sucesivas en un medio que contenía como única fuente de Nitrógeno N¹⁵. Durante estas 14 generaciones el ADN de las bacterias las bacterias se había sintetizado con bases nitrogenadas con Nitrógeno pesado (N¹⁵). Posteriormente, comprobaron que podían distinguir el ADN del las bacterias que crecían en un medio normal (con N¹⁴) del ADN de las bacterias que habían crecido durante 14 generaciones en N¹⁵. Para ello extrajeron el ADN de ambos tipos de bacterias y lo centrifugaron en un gradiente de densidad de CsCl. El resultado fue que la densidad del ADN de las bacterias que habían crecido en presencia de N¹⁵ era mayor que el ADN de las bacterias que habían crecido con N¹⁴.  Una vez comprobado que eran capaces de distinguir el ADN de ambos tipos de bacterias, continuaron el experimento de la siguiente forma: Las bacterias que habían estado creciendo en Nitrógeno pesado (N¹⁵) las pasaron a un medio de cultivo que contenía N¹⁴ (Nitrógeno normal) y a distintos tiempos, media generación, una generación, dos generaciones, tres generaciones de replicación, tomaban una muestra del cultivo bacteriano, extraían el ADN y centrifugaban en gradiente de densidad de CsCl.

Cuando extraían el ADN de las bacterias que llevaban una generación creciendo en N14 y centrifugaban en CsCl, obtenían una sola banda de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. Si extraían el ADN de las bacterias que llevaban dos generaciones creciendo en N¹⁴ y centrifugaban en gradiente de CsCl obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La absorbancia  a 260 nm es directamente proporcional a la cantidad de ADN que contiene una banda, de manera que al medir la absorbancia de las dos bandas obtenidas en la segunda generación, obtenían que ambas contenían igual cantidad de ADN (1:1). Al extraer y centrifugar en CsCl el ADN de las bacterias que llevaban tres generaciones creciendo en N14, obtenían dos bandas, una correspondiente al ADN N¹⁴ y otra de densidad intermedia (N^14-15) entre la del ADN N¹⁴ y el ADN N¹⁵. La cantidad de ADN que contenía la banda correspondiente al ADN N¹⁴ era tres veces mayor que la encontrada en la  banda de densidad intermedia (N^14-15), proporción (3:1).

Los resultados obtenidos por Meselson y Stahl (1958) se ajustaban a un modelo de replicación semiconservativo. Para asegurarse, aislaron la banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15) obtenida a partir de las bacterias que llevaban una generación en N¹⁴, desnaturalizaron el ADN de la banda mediante calor para separar sus dos hélices y, manteniéndolas desnaturalizadas, centrifugaron en CsCl. Si la replicación de E. coli se ajustaba al modelo semiconservativo, una de las hélices debería estar construida con N¹⁵ (la vieja) y la otra hélice con N¹⁴ (la nueva) y, al centrifugar en gradiente de densidad esperaríamos obtener dos bandas una más densa correspondiente a la hélice construida con N¹⁵ y otra menos densa sintetizada con  N¹⁴. El resultado obtenido por Meselson y Stahl (1958) fue precisamente el esperado para una replicación semiconservativa.

Si la replicación del ADN de E. coli se ajustará al modelo Conservativo al centrifugar el ADN de las bacterias después de un generación en medio con N¹⁴, hubieran obtenido dos bandas una de densidad correspondiente al N¹⁴  y otra de densidad correspondiente al N¹⁵. Nunca habrían observado, en este caso,  una banda de ADN de densidad intermedia (N^14-15)

bibliografia: es.wikipedia.org/wiki/Experimento_de_Meselson-Stahl

4.1 REPLICASION DEL GENOMA PROCARIOTICO

4.1 REPLICASION DEL GENOMA PROCARIOTICO.

Ocurre en tres etapas:

1ª etapa: desenrrollamiento y apertura de la doble hélice.en el punto ori.

En el punto de origen u ORI, que es un lugar del cromosoma con gran contenido de A y T, la doble hélice se abre, mediante la DNA helicasa y las proteínas desestabilizadoras de la hélice o proteínas de unión a DNA de una sola cadena, vuelven recta la cromatina y la mantienen abierta. La DNA polimerasa sintetiza las cadenas complementarias a cada una de las cadenas primitivas. Forma dos copias activas de ADN, una es continua, o sea, basta con agregar los nucleotidos correspondientes porque la hebra antigua tiene 3', por lo que se crea una 5´. En la otra hebra, se produce un proceso discontinuo, debido a que la hebra quedo con un final 5', debiendo partir con un 3', y la célula es incapaz de seguir la cadena con este final, para que se inicie la copia del DNA hace falta un corto RNA específico (10 pares de bases), denominado RNA cebador, que hace que empiece a actuar la DNA polimerasa. El RNA cebador es generado por la RNA primasa (sintetizadora de RNA). Esta enzima se une directamente a la DNA helicasa, formando un complejo llamada primosoma, que se va desplazando con la cadena en formación. Conforme van existiendo fragmentos de cadena abiertos de suficiente longitud, se va sintetizando la cadena discontinua formando pequeños fragmentos, denominados Fragmentos de Okazaki, cada uno de unos 1000 nucleótidos. . Hace falta un RNA cebador por cada fragmento de Okazaki. La RNA primasa, va sintezando a intervalos los RNA cebadores que van siendo incorporados a la copia como si fueran ADN, entre los fragmentos de Okazaki, hasta que se alcanza el RNA cebador del fragmento de Okazaki ya terminado. . La cadena con ARN cebador, es denominada cadena retrasada

El DNA sintetizado en la cadena retrasada y su cadena patrón sufren un plegamiento, de tal forma que la DNA polimerasa de la cadena conductora se unen para formar un complejo único, de modo que las proteínas de replicación puedan utilizarse conjuntamente en la replicación de ambas cadenas. Las topoisomerasas mantienen esta estructura y evitan que el DNA se enrede por superenrrollamiento, cortando un enlace fosfodiester, y a esto se le llama nick.Además, existe una proteína llamada SSB, que estabiliza la forma monocatenaria de la hebra en replicación, para que no se acople por complementariedad de bases con ella misma.

Las enzimas ligasas son las encargadas, despues, de ir arreglando los nicks cuando se sustituye el ARN cebador.

Exiten tres tipos de ADN-polimerasa, la I, es la encarga de reparar la hebra; la II, de ayudar a la III; y la III, agrega las bases a la hebra.

La labor de la ADN-pol I es exonucleasa, puede poner bases como sacar bases, con esto puede reparar la hebra. El dominio de esta proteína encargado de incluir bases a la hebra se llama Fragmento Klenow, que puede ser liberado del resto de la proteína por la Tripsina.

Bibliografia: www.unf.edu.ar/frn/Documents/MatCatedra/.../procariotas.pdf

4.2 REPLICASION DEL GENOMA EUCARIOTICO

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4.2 REPLICASION DEL GENOMA EUCARIOTICO.

LAS ADN POLIMERASAS EUCARIÓTICAS

Las ADN polimerasas eucarióticas tienen una diferencia interesante con las ADN polimerasas de E. coli, ya que se utilizan dos polimerasas diferentes una para sintetizar la hélice conductora y otra para producir la hélice retardada. La ADN polimerasa α sintetiza la hélice retardada mientras que la ADN polimerasa δ sintetiza la hélice conductora. En la siguiente tabla se resumen las polimerasas de mamíferos:

ENZIMA	FUNCIÓN
ADN Pol α	Síntesis Hélice retardada. Síntesis del cebador: 10 bases de ADN y 25 de ARN.
ADN Pol δ	Síntesis de la Hélice conductora.
ADN Pol ε	Polimerización de las Piezas de Okazaki.
ADN Pol β	Unión de los fragmentos de Okazaki (de aproximadamente 250 pb).
ADN Pol γ	Síntesis ADN mitocondrial.

REPLICACIÓN DEL ADN MITOCONDRIAL: LAZOS D

La replicación del ADN mitocondrial en mamíferos se ajusta al modelo del Lazo de Desplazamiento o lazo D.  Las dos hélices del ADN mitocondrial se pueden diferenciar en base a su densidad, existiendo una hélice Ligera (L) y otra hélice pesad (H). En primer lugar, se inicia la replicación o síntesis de la nueva Hélice Ligera (L), sin que se comience la replicación de la nueva hélice pesada. El origen de replicación de la hélice ligera (L) es diferente al de la hélice pesada (H), de forma que existen dos orígenes de replicación diferentes para cada una. Además, una vez iniciada la replicación de la nueva hélice ligera (L), la síntesis es unidireccional, tienen lugar en una sola dirección y avanza desplazando a la otra hebra. Cuando se ha sintetizado, aproximadamente, 2/3 de la nueva hélice ligera, comienza la síntesis de la nueva hélice pesada (H), en una sola dirección opuesta a la de síntesis de la hélice ligera L. Por consiguiente, la síntesis de la nueva hélice L termina antes que la de la nueva hélice H. Como se puede ver, la replicación del ADN mitocondrial es diferente a la del cromosoma de E. coli, existen dos orígenes de replicación diferentes para cada hélice y la replicación es unidireccional.

Replicación ADN mitocondrial	ADN mitocondrial

OTRAS ENZIMAS QUE INTERVIENEN EN LA REPLICACIÓN: LIGASAS, GIRASAS, TOPOISOMERASAS, ETC.

Además de las ADN polimerasas I y III, de la ARN-Polimerasa o Primasa que sintetiza el cebador y de las Ligasas que unen las piezas de Okazaki, en la replicación del ADN intervienen otras enzimas. Algunas de estas enzimas son las siguientes:

• Helicasas: son enzimas que rompen los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas de la doble hélice. Entre las helicasas de E. coli se encuentran las proteínas Dna B y Rep. La proteína Rep parece ayudar a desenrollar la doble hélice por delante de la polimerasa.
• La proteína SSB: se une al ADN de hélice sencilla y lo estabiliza retrasando la regeneración de la doble hélice.

La acción de las Helicasas durante la replicación genera retorcimientos que deben ser eliminados. El ADN circular puede sufrir enrollamientos y retorcimientos, dichos superenrollamientos se generan y eliminan por enzimas denominadas Topoisomerasas.

• Topoisomerasas: pueden producir o eliminar nudos o enlaces en una hélice. existen toposiomerasas de la clase I que cortan solamente una de las dos hélices y topoisomerasas de la clase II que cortan ambas cadenas. En E. coli, las enzimas Topi I i Topo III pertenecen a la clase I, mientras que la la Girasa es de la clase II. Cuando se separan las dos hélices durante el avance de la horquilla de replicación se producen superenrollamientos positivos en otras regiones que relajan la tensión. La Girasase necesita para eliminar los superenrollamientos positivos que se generan por delante de la horquilla de replicación.

Bibliografía:

www.ucm.es/info/genetica/grupod/Replicacion/Replicacion.htmEn caché - Similares

4.3 CONTROL GENETICO DE LA REPLICASION

4.3 CONTROL GENÉTICO DE LA REPLICACIÓN

son mecanismos moleculares (no necesariamente agregados moleculares) que verifican que se cumplen las condiciones necesarias para permitir el paso de una fase del ciclo celular a otra, impidiendo así que ciertos eventos como daños en el ácido desoxirribonucleico (ADN) trasciendan a lo largo del ciclo.
Variación de la secuencia del ADN en la línea germinal es esencial para mantener la variabilidad genética y asegurar la aparición de modificaciones que permitan una mejor adaptación al medio. Sin embargo, en la línea somática los cambios genéticos normalmente son nocivos, y las células han desarrollado estrictos mecanismos de seguridad para detectar y corregir las posibles alteraciones que haya podido sufrir el ADN. Una única alteración genómica (una mutación) que produzca una simple modificación en la cantidad producida de una proteína, o la sustitución de un único aminoácido en su secuencia, puede desencadenar una serie de variaciones que culminen con la generación de un tumor. La aparición de este tipo de errores están asociados con los fallos en los mecanismos que deberían haber detectado y corregido la lesión en el ADN que causó la mutación, o en último término, dirigido la célula afectada hacia un proceso de muerte celular. Por ello, los mecanismos que aseguran la integridad del ADN son fundamentales para el correcto funcionamiento celular.
Las modificaciones en la secuencia del ADN pueden generarse por modificaciones químicas espontáneas de sus componentes, por errores durante la replicación o por daños infligidos al ADN, debido a la presencia de agentes endógenos (generados por el propio metabolismo celular normal) o exógenos (procedentes del exterior). Entre éstos se encuentran la radiación ionizante (IR) y determinados productos químicos (véase Daño del ADN). El daño en el ADN inicia una respuesta que activa diferentes mecanismos de reparación que reconocen lesiones específicas en el ADN, que son reparadas en el momento para recuperar la secuencia original del ADN. Asimismo, el daño en el ADN provoca una parada en el ciclo celular, que conlleva la alteración de numerosos procesos fisiológicos, que a su vez implica síntesis, transporte y degradación de proteínas.

Bibliografía:

www.biologia.edu.ar/adn/adntema control genetico1.htm

4.4 REPLICASION IN VITRO (PCR)

4.4 REPLICASION IN VITRO DEL ADN (PCR)

Replicación del ADN in vitro: Reacción en cadena de polimerasa y la Agarose Gel Electrophoresis electroforesis en gel de agarosa  

I. Principle I. Principio   

Polymerase Chain Reaction Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) (PCR) is a key technique used in molecular genetics to reproduce a relatively short sequence of DNA; this segment of DNA is often a gene or a critical part of the gene and PCR amplifies Es una técnica clave utilizada en la genética molecular para reproducir una secuencia relativamente corta de ADN; este segmento de ADN a menudo es un gen o una parte crítica del gen y amplifica por PCR (ie, makes more copies of) (Es decir, hace más copias de) the sequence of interest allowing us to study just that particular sequence. la secuencia de interés que nos permite estudiar lo que la secuencia particular. Before PCR was invented, DNA amplification was done in bacteria and took weeks to accomplish. Antes de PCR fue inventada, la amplificación de ADN se llevó a cabo en bacterias y tomó semanas para llevar a cabo. PCR uses the same molecules that nature uses for copying DNA. PCR utiliza las mismas moléculas que la naturaleza utiliza para copiar el ADN.

In order to determine whether or not you amplified the correct gene or to check if that gene is present, we use agarose electrophoresis. Con el fin de determinar si está o no amplificado el gen correcto o para comprobar si ese gen está presente, se utiliza electroforesis de agarosa. Agarose creates a matrix that allows smaller DNA molecules to travel faster and larger DNA molecules to travel slower thus separating the DNA molecules according to size when applied through a electrical field. Agarosa crea una matriz que permite que las pequeñas moléculas de ADN para viajar más rápido y más grandes moléculas de ADN para viajar más lento separando así las moléculas de ADN de acuerdo con el tamaño cuando se aplica a través de un campo eléctrico.

II. II. Explanation Explicación

A. The cycling reactions: A. Las reacciones de ciclismo:

There are three major steps in a PCR, which are repeated for 30 or 40 cycles. Hay tres pasos principales en una PCR, que se repiten durante 30 o 40 ciclos. This is done on an automated thermal cycler, which can heat and cool the tubes with the reaction mixture in a very short time. Esto se hace en un ciclador térmico automatizado, que puede calentar y enfriar los tubos con la mezcla de reacción en un tiempo muy corto.

1. Denaturation Desnaturalización (94-95°C) (94-95 ° C) : :
   During the denaturation, the double strand melts, or denatures Durante la desnaturalización, la doble cadena se funde, o desnaturaliza (which means opens) (Lo que significa abre) , to single stranded DNA and all enzymatic reactions stop , Con el ADN de cadena sencilla y todas las reacciones enzimáticas detener (for example: the extension from a previous cycle) (Por ejemplo: la extensión de un ciclo anterior) . .
2. Annealing Recocido (54-60°C) (54-60 ° C) : :
   The primers are jiggling around which is caused by Brownian motion. Los cebadores se jiggling alrededor de la cual es causada por el movimiento browniano. Hydrogen bonds are constantly formed and broken between the single stranded primer and the single stranded template. Los enlaces de hidrógeno están constantemente formado y roto entre el cebador de cadena sencilla y la plantilla monocatenario. The more stable bonds last a little bit longer Los bonos más estables duran un poco más (primers that fit exactly) (Cebadores que se ajustan exactamente) and on that little piece of double stranded DNA y en ese pequeño pedazo de ADN de doble cadena (template and primer) (Plantilla y cartilla) , the polymerase can attach and start to copy the template. , La polimerasa puede conectar y empezar a copiar la plantilla. Once there are a few bases built in, the hydrogen bonds are so strong between the template and the primer that it does not break anymore. Una vez que hay unas pocas bases construidas en los enlaces de hidrógeno son tan fuertes entre la plantilla y la cartilla de que no se rompe más. The actual annealing temperature is determined by the primer sequence using their melting temperatures, referred to as Tm. La temperatura real de recocido está determinada por la secuencia del cebador utilizando sus temperaturas de fusión, referidos como Tm.
3. Extension Extensión (68 - 74°C) (68 - 74 ° C) : :
   Extension is when the free nucleotides that complement the single strand of DNA are added onto the 3' end of the primer. La extensión es cuando los nucleótidos libres que complementan la sola hebra de ADN se añadió en el extremo 3 'del cebador. This is the ideal working temperature for the polymerase. Esta es la temperatura de trabajo ideal para la polimerasa. The primers have a stronger attraction to the template, created by hydrogen bonds. Los cebadores tienen una atracción fuerte al plantilla, creado por enlaces de hidrógeno. It is more difficult to break these bonds than it is to add free nucleotides to the primers. Es más difícil de romper estos lazos de lo que es para añadir nucleótidos libres a los cebadores. Primers can bind to the single stranded DNA even if there are not exactly complementary. Los cebadores pueden unirse al ADN monocatenario incluso si no son exactamente complementaria. But if the “match” is with too few nucleotides, then there are fewer hydrogen bonds. Pero si el "partido" está con muy pocos nucleótidos, entonces hay un menor número de enlaces de hidrógeno. Thus, the primer can fall off the single stranded nucleotide because of the higher temperature and there will be no extension of the fragment Así, el cebador puede caerse el nucleótido monocatenario debido a la temperatura más alta y no habrá extensión del fragmento (the single strand of DNA you are trying to copy.) (La única hebra de ADN que está intentando copiar.)
   The bases Las bases (complementary to the template) (Complementaria a la plantilla) are coupled to the primer on the 3' side están acoplados a la imprimación sobre el lado 3 ' (the polymerase adds dNTP's from 5' to 3', reading the template from 3' to 5' side, bases are added complementary to the template) (La polimerasa añade dNTP desde 5 'a 3', la lectura de la plantilla de 3 'a 5' lado, las bases complementarias se añaden a la plantilla)

Because both strands are copied during PCR, there is an exponential increase of the number of copies of the gene. Debido a que ambas cadenas se copian durante la PCR, hay un aumento exponencial del número de copias del gen. Suppose there is only one copy of the wanted gene before the cycling starts, after one cycle, there will be 2 copies, after two cycles, there will be 4 copies, three cycles will result in 8 copies and so on. Supongamos que hay sólo una copia del gen deseado antes de que el ciclo se inicia, después de un ciclo, habrá 2 copias, después de dos ciclos, habrá 4 copias, tres ciclos se traducirá en 8 copias y así sucesivamente.

The first 4 cycles of a PCR reaction in detail in shown above. Los primeros 4 ciclos de una reacción de PCR en detalle en muestra arriba. In the 3rd cycle, two double strands of the right length are copied En el ciclo tercero, dos cadenas dobles de la longitud correcta se copian (the forward and reverse strand are the same in length) (La hebra de avance y retroceso son los mismos de longitud) . . In the 4th cycle, 8 double strands of the right length are copied. En el ciclo de 4 º, 8 cadenas dobles de la longitud correcta se copian.

    

B. Is there a gene copied during PCR and is it the right size? B. ¿Existe un gen de copia durante la PCR y es el tamaño adecuado?

Before the PCR product is used in further applications, it has to be checked if: Antes de que el producto de PCR se utiliza en otras aplicaciones, que se ha de comprobar si:

1. There is a product formed. Hay un producto formado.
   Though biochemistry is an exact science, not every PCR is successful. A pesar de la bioquímica es una ciencia exacta, no todos los PCR es un éxito. There is for example a possibility that the quality of the DNA is poor, that one of the primers doesn't fit, or that there is too much starting template. Existe por ejemplo la posibilidad de que la calidad del ADN es pobre, que uno de los cebadores no se ajusta, o que hay plantilla de partida demasiado.
2. The product is of the right size. El producto es del tamaño adecuado.
   It is possible that there is a product, for example a band of 500 bases, but the expected gene should be 1800 bases long. Es posible que exista un producto, por ejemplo una banda de 500 bases, pero el gen debe ser esperado 1800 bases de longitud. In that case, one of the primers probably fits on a part of the gene closer to the other primer. En ese caso, uno de los cebadores probablemente encaja en una parte del gen más cerca de otro cebador. It is also possible that both primers fit on a totally different gene. También es posible que ambos cebadores caber en un gen totalmente diferente.
3. Only one band is formed. Sólo una banda se forma.
   As in the description above, it is possible that the primers fit on the desired locations, and also on other locations. Como en la descripción anterior, es posible que los cebadores caber en los lugares deseados, y también en otros lugares. In that case, you can have different bands in one lane on a gel. En ese caso, usted puede tener diferentes bandas en un solo carril en un gel.

Figure: Verification of the PCR product on gel. Figura: Verificación del producto de PCR en gel.

The ladder is a mixture of fragments of known size. La escalera es una mezcla de fragmentos de tamaño conocido. Running a ladder with your PCR product allows comparison of the PCR fragments, thereby enabling identification of band size. Ejecución de una escalera con su producto de PCR permite la comparación de los fragmentos de PCR, lo que permite la identificación del tamaño de la banda. Notice that the distance between the different fragments of the ladder is logarithmic. Tenga en cuenta que la distancia entre los diferentes fragmentos de la escala es logarítmica. Lane 1: PCR fragment is approximately 1850 bases long. Carril 1: fragmento de PCR es de aproximadamente 1850 bases de longitud. Lane 2 and 4: the fragments are approximately 800 bases long. Carril 2 y 4: los fragmentos son de aproximadamente 800 bases de largo. Lane 3: no product is formed, so the PCR failed. Carril 3: ningún producto se forma, por lo que la PCR ha fallado. Lane 5: multiple bands are formed because one of the primers fits on different places Carril 5: múltiples bandas se forman porque uno de los cebadores se adapta a diferentes lugares (or perhaps there is more than one template from different species) (O quizás hay más de una plantilla de diferentes especies) . .

C. What are we looking for? The gene you will be amplifying today is called Dct- Endothelin receptor B (Ednrb) which is actually a transgene that can be inserted into another organism. C. ¿Qué estamos buscando? El gen que será de amplificación que hoy se llama dct-receptores de la endotelina B (EDNRB), que es en realidad un transgén que puede ser insertado en otro organismo. Dct, or dopachrome tautomerase, is expressed in melanocytes (pigment cells) and so by using this transgene we can target the insertion of the gene, Ednrb , thereby controlling where it is expressed. Dct, o tautomerasa dopacromo, se expresa en los melanocitos (células de pigmento) y así mediante este transgén podemos dirigir la inserción del gen, EDNRB, controlando de este modo en el que se expresa. This is very important when you want to study whether certain genes interact with each other (whether it by directly or indirectly) or not. Esto es muy importante cuando se quiere estudiar si ciertos genes interactúan entre sí (si directamente o indirectamente) o no.

To check if the Dct- Ednrb transgene was successfully passed from parent to progeny, you must check to see if Dct is present. Para comprobar si los transgenes dct-EDNRB fue aprobada con éxito de los padres a la progenie, usted debe comprobar para ver si la DCT se presente. This is because every animal alive has endogenous Ednrb and so checking for Ednrb will always be positive. Esto se debe a todos los animales vivos tiene EDNRB endógeno y lo que la comprobación de EDNRB siempre será positivo. To amplify Dct, you will use primers that anneal on each side of the Dct gene and this will direct the Taq where to begin and where to end amplification. Para amplificar Dct, que va a utilizar cebadores que se reasocian a cada lado del gen DCT y este dirigirá la Taq dónde empezar y dónde terminar amplificación. This is not a totally clean PCR, meaning that you will see some non-specific binding that will create bands that are not of interest. Esto no es una totalmente limpia de PCR, lo que significa que podrás ver algunos de unión no específica que va a crear bandas que no son de su interés. In a way it is good to have this non-specific band (which is always there regardless of whether the animal is Dct positive or not) because it indicates that the PCR worked. En cierto modo, es bueno tener esta banda no específica (que siempre está ahí, independientemente de si el animal es positivo o no Dct), ya que indica que la PCR trabajó. The band of interest (ie, indicating the animal does contain the transgene Dct- Ednrb ) is 2217bp long. This is a sensitive PCR so work cautiously. La banda de interés (es decir, lo que indica que el animal contiene el transgén dct-EDNRB) es 2217bp largo. Este es un tema delicado PCR para trabajar con mucho cuidado.

III. III. General Safety Requirements Requisitos generales de seguridad

1. 1. Always wear lab coat and gloves. Siempre use una bata de laboratorio y guantes.

2. 2. Do not talk while tubes are open as your DNA can mix in with the DNA being used and even more important, you can contaminate the reagents used in the reaction No hables mientras que los tubos están abiertos como el ADN se puede mezclar con el ADN que se utiliza y aún más importante, que puede contaminar los reactivos empleados en la reacción (and then nothing will work) (Y entonces nada va a funcionar) . .

3. 3. Hold pipetter in a vertical position, with the tip facing down. Mantener pipeteador en una posición vertical, con la punta hacia abajo.

4. 4. If using Ethidium bromide proceed with caution as it is a mutagen. Si se utiliza bromuro de etidio proceder con cautela, ya que es un mutágeno.

Bibliografía:

ww.cultek.com/.../PCR/Aplicaciones-in vitro PCR-