MEDIOS DE CULTIVO
El cultivo de tejidos, como técnica, consiste esencialmente en aislar una porción de planta (explante) y proporcionarle artificialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su potencial intrínseco o inducido. Es necesario adoptar procedimientos de asepsia para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana.
AREAS DEL LABORATORIO DEL CULTIVO DE TEJIDOS
Área de preparación; se utiliza para preparar los medios de cultivo, en este se almacenan materiales de vidrio y de plástico así como reactivos químicos. Debe de contar con mesa de trabajo, para colocar balanzas, el medidor de pH, los platos calientes con agitación y otros elementos, incluye vitrinas, estanterías, espacio para el equipo de refrigeración, incubadora y cámara de crecimiento.
Área de lavado y de esterilización; puede estar constituida por dos áreas conectadas entre si. Esta debe incluir por lo menos un lavadero grande con agua caliente y fría y una fuente de agua de alto grado de pureza (agua doble destilada, para la cual se usa un destilador de vidrio o de material no toxico y un desionizador de agua. En esta área se debe disponer de un espacio para almacenar agua destilada en botellas de plástico. Esta área debe tener un espacio para la autoclave vertical u horizontal, también se puede incluir el espacio para estufa, secadores y un lavadero con agua caliente y fría.
Área de transferencia; aquí se realiza el trabajo de excusión, inoculación y transferencia de los explantes a los medios de cultivo. Se recomienda la instalación de gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado bajo presión o la construcción de cuartos de transferencia.
Área de incubación; los cultivos son incubados en un cuarto apropiado o en gabinetes o en cámaras de crecimiento. Esta área debe proporcionar un buen control de temperatura (20-28 oC), de iluminación (variable según las necesidades: 1000 a 5000 lux) y de humedad relativa (70%-80%).
Área de observación y de examen; aquí se localizan microscopios (estéreo, compuesto, invertido y otros). El objeto de esta área es realizar observaciones periódicas de los cultivos tanto en medios semisólidos como en líquidos.
Área de crecimiento; las plantas generadas en el área de incubación se pueden trasplantar en macetas, bandejas o camas apropiadas. Después del trasplante, las plantas generalmente necesitan un acondicionamiento gradual a las condiciones de campo, el cual se puede lograr con nebulización, cámaras húmedas de plástico etc.
Área de cuarentena y de control fitosanitario; se necesita un área de para la recepción de las muestra o de las plantas destinadas a la limpieza clonal generalmente protegida contra insectos. Esta área debe estar separada del resto del laboratorio. Por otra parte el área de control sanitario se realizan pruebas necesarias para comprobar la sanidad del material vegetal, como enfermedades causadas por virus, hongos y bacterias.
Área de oficina; aquí se ubican escritorios, archivos y almacenamiento de datos, los libros de referencia y de control de laboratorio, los catálogos y otros documentos, así como equipo de computo.
MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO
Suponiendo que se establecerá un laboratorio de cultivo de tejidos de tamaño medio, se requieren, para ponerlo en funcionamiento, las siguientes piezas de equipo estándar:
Área de preparación; refrigerador, balanzas (una macrobalanza y una de precisión), potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos Erlenmeyer (125, 250 y 500 ml.), botellas y material de vidrio o plástico.
Área de lavado y de esterilización; autoclave manual o automático (grande o de mesa), destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para la esterilización y secado.
Área de transferencia; gabinete de flujo laminar, microscopio de disección con luz incidente, e instrumentos de disección: cuchillas No. 10 y No. 11, mangos para cuchillas, agujas de disección, pinzas, tijeras, navaja de afeitar, frascos con alcohol, mechero de alcohol, mascaras guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas y tacho para basuras.
Área de incubación; el cuarto debe estar acondicionado con temperatura, iluminación y humedad relativa controladas, estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima y gradillas para tubos de varios tamaños.
Área de examinación; microscopio estereoscópico, microscopio compuesto, lentes de aumento y lentes ópticos complementarios.
Área de crecimiento in vivo; macetas, suelo, bandejas, cámaras de alta humedad.
COMPONENTES DEL MEDIO DE CULTIVO
En la actualidad existen innumerables formulaciones cada una de las cuales contiene entre 15 y 35 compuestos químicos que suministran:
a) Carbono
b) Nutrimentos minerales
c) Vitaminas
d) Agente gelificante
e) Sustancias reguladoras de crecimiento
f) Otros compuestos
FUENTES DE CARBONO
Muy pocos de los medios de cultivo in vitro son autótrofos, y por lo tanto es necesario agregar al medio una fuente de carbono. La sacarosa (2% a 5%) es el azúcar que mas se utilizada, y se puede remplazar por glucosa y en menor medida por fructosa; en general, la maltosa y la galactosa son menos efectivas. La incorporación de mioinositol al medio (100 mg/litro) generalmente da como resultado un mejor crecimiento de callos y suspensiones celulares.
NUTRIMENTOS MINERALES
Cualitativamente los medios de cultivo aportan los mismos elementos (macro y micronutrimrntos) que se consideran esenciales para el crecimiento de las plantas enteras. En los medios de reciente desarrollo (MS, B5, N6) cabe destacar las concentraciones relativamente altas de nitrógeno y potasio con respecto al medio de White. El nitrógenos suministra en forma de nitrato o solo amonio como fuente nitrogenada, en este ultimo caso el medio debe contener también acido cítrico, succínico o málico. Otras fuentes de nitrógeno incluyen glutamina, urea y caseína hidrolizada.
VITAMINAS
Son también empleadas por ellas para su crecimiento y diferenciación con papeles catalíticos en el metabolismo. Las vitaminas que son adicionadas más usualmente como parte del medio sintético son: tiamina-HCl, ácido nicotítico, piridoxina-HCl, biotina, ácido fólico, ácido pantoténico, riboflavina.
AGENTE GELIFICANTE
En los medios semisólidos comúnmente se le adiciona agar (0.6% a 1.0%). Se debe considerar especialmente la pureza del agar, la marca comercial y las concentraciones de agar utilizado pueden alterar las respuestas in vitro de los cultivos ( Debergh, 1982).
REGULADORES DE CRECIMIENTO
En algunos casos se obtienen en los cultivos in vitro las respuestas deseadas mediante el empleo del MS sin reguladores de crecimiento. Sin embrago en la mayoría de los casos se hace necesario agregar al medio sustancias reguladoras de crecimiento, generalmente del tipo auxinas o las citocininas.
Auxinas
OTROS COMPUESTOS
Existe una larga lista de componentes que se han adicionado ocasionalmente a los medios de cultivo por ejemplo:
Agua de coco
Jugo de frutos de tomate
Extracto de levadura
Extracto de tubérculos de papa
Aminoácidos (asparagina, cisteína y L-tirosina)
Ácidos orgánicos (cítrico, málico, succínico y pirúvico)
PREPARACION Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK
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PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Es necesario preparar el medio de cultivo utilizando agua destilada o agua desmineralizada-destilada. Se debe evitar el almacenamiento prolongado del medio para evitar la acumulación de contaminantes; todas las sustancias utilizadas para su preparación deben ser de un alto grado de pureza. El procedimiento para la preparación de los medios dependerá, en primera instancia, del tipo de medio, de su consistencia y de la presencia de compuestos termolábiles. En general se pueden distinguir:
Medios líquidos con sustancias termolábiles. Para su preparación se sigue el mismo del inciso a, pero sin adicionar agar, y haciendo la esterilización por filtración, en el caso de medios que contengan sustancias termolábiles.
Medios semisólidos con una o más sustancias termolábiles; para su preparación se siguieren las siguientes operaciones:
FACTORES QUE INTERVIENEN EN EL PROCESO DE ESTERILIZACION
FISICOS
Fuego directo:
Muflas- (estufas
Filtración:
QUIMICOS
NaClO (hipoclorito de sodio
Oxido de etileno
Ozono
HgCl2 (bicloruro de mercurio): es la mejor sustancia a utilizar
H2O2 (peroxido)
Nitrato de plata
Aldehido
Fenol
Alcohol
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original depende de los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS
· ETAPA 0. Establecimiento de plantas donadoras de explante: es aquella donde se siembra la planta y de esa misma planta se extrae el explante que se va a cultivar.
· ETAPA 1. Instalación aséptica: es cuando la planta se coloca en condiciones con mucha asepsia en un medio de cultivo.
· ETAPA2. Multiplicación: es cuando se lleva a cabo el sub-cultivo (la multiplicación in vitro), es decir la micropropagación.
· ETAPA 3. Enraizamiento: es donde se lleva a cabo el enraizamiento de la planta, esta se saca del medio de cultivo y se coloca en una maceta.
· ETAPA 4. Adaptación a campo: esta etapa es la etapa final, en ella se lleva a cabo el trasplante de la planta directamente a campo.
SELECCION DE PLANTAS MADRE
Con la selección de plantas madre se pretende elegir a los individuos con características más deseables para que funjan como progenitores. Una buena selección de plantas madre orientadas a la producción, son aquellas plantas que han sido criadas y seleccionadas con la finalidad de poder obtener de ellas esquejes o clones idénticos que sean 100% viables para su producción; es decir, que las plantas o los tallos, que son capaces de formar nuevas raíces dan lugar a nuevos ejemplares (esquejes o clones) idénticos genéticamente a la planta original.
Las plantas madres yemeras deben ser identificadas y seleccionadas teniendo encuenta los criterios siguientes:
Tolerancia a plagas y enfermedades.
Buena producción.
Es importante recalcar que los mejores resultados se obtienen de plantas sanas y seleccionadas por sus especiales características, con al menos dos meses de edad, y que no hayan sido refloradas. Las plantas hembras que han sido inducidas a florar y después a revegetar producen menos esquejes y de peor calidad, débiles y de lento enraizado.
En cuanto al tamaño del explante se ha postulado como regla general, que en la medida que el explante es mas pequeño, menor es su capacidad de supervivencia, lo cual es lógico, si se tiene en cuenta que un menor numero de células son las que deben asumir el crecimiento y que el estrés de separación del explante es mayor, cuando es mas pequeño. Este principio aplicable tanto a tejidos diferenciado como a callos, se ha manifestado en distintos ensayos.
SIEMBRA DEL EXPLANTE
En este proceso se toma un frasco con medio de cultivo se quita el sello, posteriormente se toma con una pinza (previamente esterilizada) el explante y se coloca dentro del medio de cultivo, esto cuidando que la yema quede hacia arriba,tomanado en cuenta la polaridad de la planta madre; ya que puede llegar a suceder una polaridad invertida la cual va a depender de los ápices, raíces, hojas, semillas, tallos y yemas, en que se siembre la planta así. Tambien es importante hacer esto cerca del fuego y no introducir la mano dentro del frasco con el medio de cultivo, es también de mucha importancia no colocar la tapa boca abajo ni tocar la parte interior de la misma. Una vez sembrado el explante se cierra fuertemente el frasco y de esterilizan de nuevo las pinzas para realizar el mismo procedimiento al sembrar el siguiente explante.
CONDICIONES DE INCUBACION
Para las condiciones ambientales de incubación es conveniente que los cultivos sean incubados en ambientes controlados, en lo que se refiere a la luz y a la temperatura, etc.
CAMBIOS FISIOLOGICOS DEL EXPLANTE
Los cambios fisiológicos o sensibilidad dependen mucho de las condiciones en que se encuentre la planta, y se expresa como un cambio de comportamiento ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con frecuencia, y son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales. Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
TRANSPLANTE AL SUSTRATO
Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales.
Por ello se debe dar mediante una climatización, ya que una planta puede durar entre 4 a 8 semanas en rusticar en un medio.
www.slideshare.net/tlos/cultivos-de-clulas-y-tejidoswww.tnt-lab.com.ar/productos_cultivo.htm
yactivany.blogspot.com/2012/.../2-1-5-preparacion-y-manejo-de.htm...
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