practica extraccion y separacion de DNA

PRACTICA: EXTRACCIÓN Y SEPARACIÓN DE DNA

ANTECEDENTES

Además del agua, los carbohidratos, las proteínas y los lípidos, los seres vivos están constituidos por otras moléculas que, aunque en menor cantidad, desempeñan funciones muy importantes.

 Los ácidos nucleícos (DNA y RNA) son biomoléculas solubles en agua que desempeñan funciones diversas. Son moléculas complejas producidas por las células vivas; son esenciales para todos los organismos vivos. Estas moléculas gobiernan el desarrollo del cuerpo y sus características es ecíficas, ya que proporcionan la información hereditaria y ponen en funcionamiento la producción de proteínas.

OBJETIVÓ

Extraer DNA y RNA de tejidos animales o vegetales e identificarlos como tales.

MATERIAL

Ø  1.-Tubos de centrifuga 1ml

Ø  Tubos de ensayo de 5ml

Ø  Centrifuga

Ø  Micropipetas de 1000 y 200 ul

Ø  Agua destilada estéril (20 ml para todos)

Ø  Etanol al 100% frio (20 ml es suficiente

Ø  NaCL 3M

Ø  Buffer de extracción de ADN (Urea, NaCl, EDTA, 20 ml es suficiente para todos)

Ø  Fenol/cloroformo/isoprapol frio (20 ml es suficiente para todos)

Ø  Mortero y pistilo

Ø  Aguacate, cacahuate, hojas, carne, hígado, sangre.

Ø  Papel aluminio

Ø  Cleenpack

Ø  Guantes

PROCEDIMIENTO

A)   Rompimiento de membranas y paredes celulares

Tomar una muestra de tejido (5 gr. Aprox.) que haya elegido y homogeneízalo, es decir molerlo con el mortero, si el tejido es muy duro licúarlo en seco.

B)   Digestión

Colocar la muestra molida (1 gr. Aprox.) en un tubo de eppendorf de 1 ml y agrégarle el Buffer de extracción (tris-HCL 0.005 M, EDTA 0.02 M, NaCl 0.35 M, Urea 7 M) a temperatura de cuarto (500 ul Aprox.).

Cuando se haya agregado el Buffer de extracción a la muestra, agítarla e incúbala por 10 minutos con agitación esporádica.

C)   Separación de Proteínas, Carbohidratos y Lípidos   

A la mezcla que tienes en un tubo de ensayo agrégarle 500 ul. De Fenol/cloroformo/isopropanol frio usar guantes y no inhalar los vapores.

Agitar vigorosamente en Vortex, cuidando que no se tire el contenido del tubo, dejar reposar a temperatura ambiente por 5 minutos.

Extraer la fase acuosa (500 ul Aprox.) con una micropipeta. Si no se separan las fases centrifúgala a 10,000 rpm por 5 min. Ten cuidado de equilibrar la centrifuga.

Extraer la fase acuosa superior una vez centrifugada.

D)   Precipitación de ácidos nucleícos DNA y RNA

A la fase acuosa que extraes (500 ul), coloca en un tubo eppendorf limpio y agrégale 400 ul. De etanol (100%) frio y 75 ul de NaCl 3 M. mezcla por inversión, suave y observa cómo se precipita el DNA.

D) Recuperación de la pastilla.

Centrifuga tu tubo por 2 min a 10,000 rpm, recoge la pastilla del fondo del tubo.

E) Resuspension

Resuspende tu pastilla de DNA en 5 ml de agua destilada estéril.