Almacenamiento, descongelación y post-tratamiento.
Los meristemos se mantienen en nitrógeno líquido por al menos 20 min. Para la descongelación, las cintas de papel aluminio se enjuagan en 10 ml de solución post-tratamiento en un pequeño plato Petri a temperatura ambiente. Después de pocos segundos, los meristemos se separan del papel aluminio y se mantienen por otros 15 min en la solución post-tratamiento. Como tal, la solución tóxica PVS2 es removida durante la descongelación y reemplazada por una solución post-tratamiento menos tóxica. La solución post-tratamiento consiste de 1.2 M (= 410.4 g/L) de sacarosa disuelta en el medio MS (pH 5.8).
Descongelación y recuperación.
Después del almacenamiento, la descongelación rápida se realiza revolviendo el criotubo congelado en un baño María o en un vaso con agua a 40°C por 90 segundos.
La regeneración de los meristemos congelados puede ser efectuada de dos maneras diferentes:
• Los meristemos se transfieren a platos Petri de 9 cm que contienen el medio de regeneración semisólido (P6) y sellados con parafilm.
• Alternativamente, la regeneración puede ser realizada en un medio líquido. Los meristemos descongelados se transfieren a frascos Erlenmeyer de 100 ml que contienen 30 ml de medio de regeneración líquido (P6 sin agentes solidificantes) y se colocan en un agitador rotativo a 70 rpm.
Después de una semana de cultivo en condiciones de oscuridad, los platos Petri y los frascos se transfieren a una luz continua a 50 μE m-2 s-1. Los cultivos se mantienen todo el tiempo a 25 ± 2°C.
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